酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒是酶免疫測(cè)定中廣泛應(yīng)用的技術(shù)。基本方法是將已知的抗原或抗體吸附到固相載體的表面，使酶標(biāo)記的抗原和抗體在固相表面反應(yīng)，并用洗滌法洗去液相中的游離成分。常用的ELISA酶聯(lián)免疫吸附法包括雙抗體夾心法和間接法。前者用于檢測(cè)大分子抗原，而后者用于檢測(cè)特異性抗體。
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，不改變抗體的免疫特性或影響酶的生物活性。這種酶標(biāo)記的抗體可以特異性地結(jié)合抗原或吸附在固相載體上的抗體。滴加底物溶液后，底物可以在酶的作用下將其氫供體從無(wú)色還原形式變?yōu)橛猩趸问剑瑥亩a(chǎn)生顯色反應(yīng)。因此，相應(yīng)免疫反應(yīng)的存在與否可以通過(guò)底物的顯色反應(yīng)來(lái)確定，并且顯色反應(yīng)的深度與樣品中相應(yīng)抗體或抗原的量成比例。這種顏色反應(yīng)可以使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒檢測(cè)器進(jìn)行定量測(cè)量，該試劑盒檢測(cè)器將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，使酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒方法成為一種特異而靈敏的檢測(cè)方法。
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒操作步驟
1.確定本試驗(yàn)所需的酶聯(lián)抗體涂層孔的數(shù)量。
2.將0.1ml稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品依次加入一排7孔中，每孔只加入樣品稀釋液作為對(duì)照。處理后，每孔添加100μl樣品。
3.在酶聯(lián)板上加一個(gè)蓋子，在37℃下反應(yīng)90分鐘。
4.反應(yīng)結(jié)束后，使用自動(dòng)洗板機(jī)將液體從酶標(biāo)板上去除；或者，抖掉酶聯(lián)板上的液體，在吸水紙上拍幾下。清洗兩次。
5.按每孔0.1ml的順序加入制備的生物素抗體工作液。在37℃下反應(yīng)60分鐘。
將6.0.01M TBS或0.01M PBS洗滌3次，每次浸泡約1分鐘。
7.按每孔0.1ml的順序加入制備好的ABC工作溶液。在37℃下反應(yīng)30分鐘。
用8.0.01M TBS或0.01M PBS洗滌5次，每次浸泡約1-2分鐘。
9.依次向每個(gè)孔中加入0.1ml TMB顯色工作液，在37℃下進(jìn)行暗反應(yīng)。在反應(yīng)過(guò)程中，有必要定期觀察。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)樣品的前3-4孔具有肉眼可見(jiàn)的清晰的藍(lán)色梯度，并且最后3-4孔之間的差異不顯著時(shí)，可以添加0.1ml/孔的TMB終止溶液。（顯色反應(yīng)不應(yīng)超過(guò)30分鐘）。
10.使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法在450nm處測(cè)量O.D.值。
11.根據(jù)樣品的吸光度值，在坐標(biāo)中找到相應(yīng)的濃度。用戶還可以使用各種應(yīng)用軟件進(jìn)行計(jì)算。需要記住的是，由于樣品稀釋了N倍，實(shí)際濃度應(yīng)為×N
